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Autor: Betreff: Alternative zur Hefezellzahlbestimmung Niko   Gast erstellt am: 20.4.2005 um 16:41   Hallo Hobbybrauer, es wird in vielen threads immer wieder über die benötigte Hefemenge für die Gärung diskutiert und eine gewisse Unsicherheit ob man nun zu wenig oder sogar zu viel Hefe eingesetzt hat spielt immer mit. Die Empfehlung von Heavybyte von ca. 1 % Hefesuspension zum Anstellen hat sich ja in der Praxis gut bewährt. Die Umsetzung der Angaben aus der Fachliteratur ist für den Hobbybrauer allerdings sehr schwierig umzusetzten. Von Narziss gibt es eine Angabe von 15*10e6 Zellen/ml Würze. Doch wie soll man die Lebendzellzahl bestimmen? Auf einer amerikanischen Seite wird der Einsatz einer Zählkammer mit einem Mikroskop empfohlen ( http://www.foamblowers.com/Article-Yeast.html. Die Zählkammer ist ein geschliffener Objektträger mit einem sehr kleinen Zählraster und einem def. Volumen. Daraus kann man auf das Gesamtvolumen des Starters zurückrechnen. Ein einiigermaßen gutes Mikroskop ist allerdings sehr teuer. Nun was soll das ganze Gerede von mir. Ich möchte euch gerne eine einfache Messmethode aus dem Laboralltag vorstellen, die vielleicht kostengünstig und einfach (für alle Elektronikbastler) zu verwirklichen ist. Im Routinebetrieb messen wir die Trübung der Hefesuspension mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Praktisch misst man einen Nullwert (nur Würze ohne Hefe) und danach die Hefesuspension und liest die Extinktion ab. Die Extinktion berechnet sich aus dem Lambert-Beerschen Gesetz ( http://www.faes.de/MKA/MKA_Photometrieeinfuehrung/mka_photometrieeinfuehrun g.html. Eine optische Dichte von 1 entspricht aus Vergleichsmessungen einer Hefezellzahl von 20*10e6 Zellen/ml. Wenn man für die Gärung eine Zellzahl von 15*10e6 Zellen/ml einsetzten soll macht das für 20 l Würze eine Gesamtzellzahl von 30*10e10 Hefezellen. Bei einem Hefestarter den ich unter Laborbedingungen in 2 Tagen bei 25 °C hochziehe erhalte ich eine Zellzahl von2,8 *10e8 Zellen/ml. Das entspricht einer OD600nm von 14. Da man nicht die Absorption sondern die Streuung der Hefezellen misst müssen die Proben verdünnt werden. Für 20 l Würze muß ich also rund 1 L Starter kultivieren. Das sind ca. 56 g Feuchtgewicht (nach Zentrifugation) oder ca. 7 g Trockengewicht. Gut das ist jetzt nur ein Beispiel da ich weiß das keiner zu Hause einen Schüttelinkubator oder Fermenter hat, aber die Zeit ist ja nicht so relevant. Für ein einfaches Photometer (sehr vereinfacht) braucht man theoretisch eine Leuchtdiode (600 nm Wellenlänge ), eine Küvettenkammer, eine Photozelle und einen Operationsverstärker Ein einfaches Photometer ist hier beschrieben http://members.telering.at/anton.gabriel/photo1.htm . Die Kosten dürften wohl sich wohl um die 50 Euro halten. Die Nachteile bei dieser Methode sind die nötigen Verdünnung ab einer OD von 0,4, weil sonst nicht im linearen Bereich gemessen wird und keine Aussage über die Vitalität der Hefezellen. In der Praxis hat sich diese Methode allerdings sehr gut bewährt, da sie sehr schnell und effektiv funktioniert. Beim Hochziehen der Hefestarter könnte man als Hobbybrauer das Wachstumsverhalten seiner Starterkulturen beobachten und über die Ermittlung der spezifischen Wachstumsrate Schlüsse über die Vitalität der Zellen ziehen. Aber das ist jetzt etwas weit gegriffen. Vielleicht konnte ich ja einigen von der Elektronikbastelfraktion einige Anregungen geben. Viele Grüße Niko Jakobus Posting Freak Beiträge: 813 Registriert: 21.1.2005 Status: Offline Geschlecht: erstellt am: 20.4.2005 um 16:55   Zitat: Praktisch misst man einen Nullwert...und danach die Hefesuspension und liest die Extinktion ab. Die Extinktion berechnet sich aus dem Lambert-Beerschen Gesetz ... Da man nicht die Absorption sondern die Streuung der Hefezellen misst... Da wirst du aber mit dem Lambert-Beerschen Gesetz nicht sehr weit kommen! E=epsilon*c*d E wie Extinktion, Epsilon als molarer Extrinktionskoeffizient, c der Konzentration und d die Schichtdicke. Mit Steuuung hat Lambert-Beer nix zu tun! Beide Messverfahren sind vielleicht brauchbar für diesen Zweck, aber man müsste sich eines raussuchen, und nicht beide miteinander vermischen! Antwort 1 Niko   Gast erstellt am: 20.4.2005 um 17:12   Hallo Jakobus, da spricht wahrscheinlich der Chemiker. ich weiß das Streuung mit Lambert-Beer nichts zu tun hat bzw. es nur sehr begrenzt gilt. Eine Absorption soll ja auch nicht gemessen werden. Darum geht es hier ja auch nicht. Mit dem Verfahren wird ja nur eine Trübungsmessung mit dem Photometer durchgeführt wie es in der Abwasseranalytik auch gemacht wird. Es ist sicherlich besser von einer scheinbaren Extinktion zu sprechen. [Editiert am 20/4/2005 von Niko] Antwort 2 Jakobus Posting Freak Beiträge: 813 Registriert: 21.1.2005 Status: Offline Geschlecht: erstellt am: 20.4.2005 um 17:34   Zitat: da spricht wahrscheinlich der Chemiker. Genau! Zitat: Lambert-Beer...nur sehr begrenzt gilt. Er gilt überhaupt nicht. Dafür gibt es andere Gesetzmäßigkeiten, wie z.B. Tyndall. Natürlich kommt hinten weniger Licht raus, und das ist u.U. auch proportional zu c und d, aber das epsilon hat da per Definition rein gar nix verloren. => kein Lambert-Beer! Ein Photometer kann ab einer bestimmten Trübung auch überhaupt nicht mehr richtig messen. Es gibt aber Laborgeräte, die die Trübung messen. Dabei wird die Lichtintensität gemessen, die unter einem bestimmten Winkel, z.B. 25° und 90°, von einer trüben Probe gestreut wird. [Editiert am 20/4/2005 von Jakobus] Antwort 3 Niko   Gast erstellt am: 20.4.2005 um 17:43   Hallo Jakobus, ich hoffe Du verstehst den Grundgedanken meines posts. Ich wollte keine spektroskopische Diskussion entfachen, sondern ein einfaches Verfahren vorstellen, bei dem sich bei einem Chemiker wahrscheinlich die Fußnägel umkrämpeln. Lambert-Beer war vor allem zur Information gedacht. Hier werden ja keine Absorptionen von echten Lösungen gemessen. Ich sprach ja auch schon den begrenzten Messbereich an in dem man überhaupt messen kann. Diese Messmethode wird in mikrobiologischen Laboratorien auf der ganzen Welt angewendet. Man muß die Fehlerquellen natürlich kennen und im Auge behalten. Grüße Niko Antwort 4 Jakobus Posting Freak Beiträge: 813 Registriert: 21.1.2005 Status: Offline Geschlecht: erstellt am: 20.4.2005 um 17:51   Zitat: ich hoffe Du verstehst den Grundgedanken meines posts. Sicher verstehe ich. Ich möchte aber auch auf die Zusammenhänge hinweisen, und nach möglichkeit Fehlerquellen von vornherein eliminieren. Und dazu würde ich eine gewinkelte Messanordnung vorschlagen (s.o.) Die Idee finde ich sehr toll, und das ist so mein "Zweithobby", bierbezogene Laborgeräte, die normalerweise schweineteuer sind, nachzubauen (meist zum tausendstel Preis...) und einigermaßen gut zu kalibrieren. Mein neuestes "Schätzeisen" ist ein Alkoholsensor, mit dem ich irgendwann mal den Alkoholgehalt direkt bestimmen kann/will! Ich wollte Dich also nicht entmutigen oder das ganze vorhaben ablehnen, sondern wollte nur einen Verbesserungsvorschlag für eine gute Idee liefern! Antwort 5 Niko   Gast erstellt am: 20.4.2005 um 17:56   Hi Jakobus, Zitat: Ich wollte Dich also nicht entmutigen oder das ganze vorhaben ablehnen, sondern wollte nur einen Verbesserungsvorschlag für eine gute Idee liefern! Das habe ich von Anfang an! Über den speziellen Aufbau dieses einfachen Photometers kann ich auch nicht mehr so viel beisteuern, aber ein Gerät für 500 oder 1000 Euro braucht man für diese einfachen Messungen sicherlich nicht. Nach welchem Prinzip funktioniert denn dein Alkoholsensor? Tschüß Niko [Editiert am 20/4/2005 von Niko] Antwort 6 Jakobus Posting Freak Beiträge: 813 Registriert: 21.1.2005 Status: Offline Geschlecht: erstellt am: 20.4.2005 um 18:22   Das ist ein Halbleiter-Sensor vom Taguchi-Typ. Kannst Du Dir etwa so vorstellen, ein EtOH-Molekül kommt an einer beheizten SnO2-Oberfläche vorbei, und wird oxidiert, dabei sinkt der "Wiederstand" des Sensors, weil er Elektronen abgeben muss. Wenn's Dich genau interessiert schicke ich Dir eine Kopie aus dem Cammann, Instrumentelle analytische Chemie. Antwort 7 heavybyte   Gast erstellt am: 20.4.2005 um 20:57   Hallo Niko, du weisst, ich bin ein Pragmatiker. Deine Idee fasziniert mich. Vor allem deshalb weil sie meinem Grundgedanke - komplizierte Laborvorgänge auf eine für Hobbbyrauer machbare und nachvollziehbare Weise zu vereinfachen - absolut entgegen kommt. Ich kann sehrgut nachvollziehen, dass eine photometrische Messung, vor allem wenn es sich wie bei uns immer um dieselben bekannten Stoffe handelt, ein verwertbares Ergebnis bringt. Wenn ich, wie du schreibst, vorher meine Nährlösung zu Null eiche und dann nurnoch Hefezellen hinzukommen, die Lichtdurchlässigkeit messe, muss sie ja in einem bestimmten Verhältnis zur Menge der Zellen stehen. Etwas anderes wäre es, wenn man wechselnde Verunreinigungen durch unbekannte Stoffe hätte, aber das ist bei uns ja nicht gegeben. Ich bin elektrisiert Antwort 8 Niko   Gast erstellt am: 21.4.2005 um 09:27   Hallo, @ Jakobus: Das ist sehr interessant. Ich glaube an das Buch komm ich bei unseren Chemikern in der Fachbibliothek heran. @Heavybyte: Freut mich das dir diese Idee gefällt. Ich habe mir das auch schon gedacht das du einer der ersten sein wirst der diese Messung umsetzt. Zitat: Vor allem deshalb weil sie meinem Grundgedanke - komplizierte Laborvorgänge auf eine für Hobbbyrauer machbare und nachvollziehbare Weise zu vereinfachen - absolut entgegen kommt. Das schöne hiebei ist ja sogar die Tasache, daß es sich gar nicht um eine komplizierte Messung handelt. Deswegen bin ich ja auch darauf gekommen euch diese Möglichkeit vorzustellen, da sie für das Hobby umzusetzten ist. Man könnte sich natürlich auch ein kleines Laborphotometer von Hach oder so kaufen, mit dem man in verschieden Wellenlängenbereichen messen kann und somit eine Analyse der wichtigsten Wasserparameter vornehmen kann. Das ist aber wohl eher etwas für den ambitionierten Aquarianer, der ständig seine Wasserwerte im Auge behalten muß. Die Geräte bekommt man auch nicht unter 500 Euro. Tschüß Niko Antwort 9 heavybyte   Gast erstellt am: 21.4.2005 um 09:44   Hallo Niko, der Grundgedanke ist in der Tat ziemlich einfach. Was meiner Meinung nach am Schwierigsten ist, ist die Wellenlänge herauszufinden welche zwar von den Hefezellen entsprechend gedämpft, aber durch die übrigen Farb- und Trübstoffe des Bieres nicht beeinflusst wird. Oder sollte das eventl. garkeine Rolle spielen weil die Nährlösung mitsamt ihrer Trübung ja vorher zu Null geeicht wird? hmmm... hast du da schon konkrete Vorstellungen, oder ist das im Moment nurso dahergedacht? Inwieweit spielt die von dir erwähnte Wellenlänge von 600nm eine Rolle? Ich kann mir vorstellen, dass man zur Analyse unbekannter Stoffe im Wasser verschiedene Wellenlängen braucht auf welche diese Stoffe besonders reagieren. Aber bei unserem Bier wird ja eigentlich nichts analysiert, sondern nur die Zunahme der Lichtabsorbtion durch Hefezellen, da sollte die Wellenlänge doch eigentlich keine Rolle spielen? ok, vielleicht um Verfäschungen durch das Raumlicht (Umgebung/Beleuchtung) auszuschliessen. Also wenn du mehr darüber weisst, dann nur her damit. Cheers Antwort 10 Niko   Gast erstellt am: 21.4.2005 um 10:08   Hallo Heavybyte, 600 nm ist eine der Standardwellenlängen die für diese Messungen benutzt werden, da wenig Licht von den Nährmedien absorbiert werden. Ich kenne aber auch Leute die bei 500 nm oder 550 nm messen. Die Messung bei 600 nm hat sich als Standard herauskristalisiert und ist auf sehr vielen Protokollen in der Praxis zu finden. Du kannst ja mal ein paar Stichwörter zu diesem Thema in Google eingeben. Da findest Du sehr viel Anleitungen von Mikrobioliegepraktika usw. Man könnte sicherlich auch mit einem Tageslichspektrum messen. Die Verfälschung durch Tageslicht ist wahrscheinlich größer. Die Messung Messung bei 600 nm hat sich auch ergeben , weil alle ein Photometer im Labor stehen haben. Es gibt mittlerweile kleine Laborphotometer für das biologische Labor zu kaufen wo die OD-Messung bei 600 nm fest programmiert ist. Ich selber messe ja auch meine Proben und das Nährmedium geht farblich von durchsichtig bis braun. Wichtig ist immer nur die Nullmessung mit dem gleichen Medium und keine zu starken Trübungen. Die Proben müssen bei zu starker Trübung verdünnt werden. Aber auch das ist zu Hause leicht möglich. Tschüß Niko Antwort 11 Malte Posting Freak Beiträge: 1542 Registriert: 16.9.2004 Status: Offline Geschlecht: erstellt am: 21.4.2005 um 10:54   Hallo! Schon recht interessant die Idee! Die Hefezellzahl wird bei uns im Labor ebenfalls mit einem speziellen Messgerät auf Photometerbasis gemessen. Dieses Gerät wird aber einmal im Jahr durch das von Niko schon erwähnete Auszählen unter dem Mikroskop überprüft! Im Betrieb wird die Hefezellzahl durch Zentrifugation ermittelt! Ich frage mich aber trotzdem, ob ein Hobbybrauer unbeding die Hefezellzahl bestimmen muss. Das machen an sonsten nur Großbrauereien. Keine Hausbrauerei würde auf so eine Idee nie kommen. Da gibbet zweimal im Jahr neue Hefe und beim Anstellen einfach rein damit! Eine richtige bzw. immer gleichbleibende Zellzahl ist schließlich nur unerlässlich, wenn man IMMER ein möglichst exakt gleiches Bier brauen möchte! Das nur mal für die kollegen, die jatzt in Panik verfallen sind weil sie ihre Hefezellzahl noch nie bestimmt haben! Zum eichen eines solchen Fotometers müsste man die Zellen aber dennoch auszählen. Man bekommt ja immer die Trübungsdifferenz zwischen Nährmedium und Hefezellen mit Nährmedium. Wenn man dann eine probe mit wenigen und eine mit vielen Hefezellen auszählen könnte, dann kann man den Bereich dazwischen genau aufteilen. Natürlich nur, wenn die Trübung linear (heißt doch so, oder?) zunimmt. Und wo wir grade bei Photometer sind: Die Bierfarbe wird ebenfalls mittels Photometer bei 430nm Wellenlänge festgelegt. Das ist auch immer interessant zu sehen, was für eine Farbe das Bier denn jetzt hat! Da wird natürlich immer mit dest. Wasser auf Null gestellt! Und Farben ab so 60-70 EBC müssen auch verdünnt werden. Vielleicht kann man diese beiden messungen in einem Gerät verienen? Änderbare Wellenlänge? Oder beides bei einer Wellenlänge? Gruß Malte [Editiert am 21/4/2005 von Malte] ____________________ "Zeige mir eine Frau, die wirklich Gefallen am Bier findet, und ich erobere die Welt." Kaiser Wilhelm II (1859-1941) Antwort 12 heavybyte   Gast erstellt am: 21.4.2005 um 11:10   Hi nochmal Malte, du hast schon Recht, dass man die genaue Zellzahl nur durch Auszählen und entsprechendem Eichen finden kann und dass das für Hobbybrauer nicht ganz so relevant ist. Dennoch, wenn solch ein versimplifiziertes Gerät nur imstande wäre zu sagen, dass die Zehzahl grösserX oder kleinerX ist, wäre manchen Leuten schon geholfen. Schaumal hier durchs Forum wie oft Hobbybrauer verunsichert sind ob sie denn genug Hefe in ihrem Sud hatten. Viele Sude bringen nämlich garnicht das erhoffte Ergebnis weil unter chronischem Hefemangel leidende Hobbybrauer einfach zuwenig Hefe ansetzen und dann staunen, dass ihr Sud nur zur Hälfte herunter gärt. So genau müsste solch ein Gerät garnicht sein. Wenn man drei Eckpunkte hätte, z.B. Null, Mittelwert und HoherWert könnte man durch Interpolation relativ gut die Zelldichte bestimmen. Wichtig wäre nur annäherungsweise zu wissen wie es mit der Hefe bestellt ist. Cheers [Editiert am 21/4/2005 von heavybyte] Antwort 13 Malte Posting Freak Beiträge: 1542 Registriert: 16.9.2004 Status: Offline Geschlecht: erstellt am: 21.4.2005 um 11:26   Hallo Heavybyte! Jep, da ist schon was dran. Aber wenn ich mir so ein gerät zulegen würde, dann muss es mir schon ein (im Rahmen der Messgenauigkeit) gutes Ergebniss liefern. Also einen Wert. Entweder ganz oder garnicht! Für einen Anfänger, der noch wenig Erfahrung mit dem Hochziehen von Hefe hat kann das Gerät helfen. Aber wenn man erstmal Erfahrung gesammelt hat, dann kann man das auch ganz ohne Hilfsmittel erkennen. Ich gehöre zwar auch noch zu den Hefezucht-Anfängern, aber durch meine Arbeit weiß ich wie eine ordentliche Hefe aussehen muss. Wenn ich soetwas im Erlenmayer habe, dann weiß ich dass die Hefezellzahl reicht. Bei meinem letzten Versuch hat das ja leider nicht geklappt. Ich versuche jetzt übrigens deine NaCl Beutel Methode mit der Flasche zu machen, um die hefe wenigstens einmal zu verwenden. Hab sie jetzt umgedreht und kann dann mit der Spritze die Hefe direkt hinter der Membran konzentriert abziehen! Mal schauen... Gruß Malte ____________________ "Zeige mir eine Frau, die wirklich Gefallen am Bier findet, und ich erobere die Welt." Kaiser Wilhelm II (1859-1941) Antwort 14